Une compréhension très précise de CRISPR
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En comprenant précisément les mécanismes de CRISPR-Cas3, les chercheurs proposent des instantanés de niveau atomique sur le CRISPR en général.
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Les scientifiques de la Harvard Medical School et de l’Université Cornell ont généré des instantanés d’une résolution proche du niveau atomique de CRISPR qui révèlent des étapes clés dans son mécanisme d’action. Les résultats, publiés dans Cell, fournissent les données structurelles nécessaires aux efforts visant à améliorer l’efficacité et la précision du CRISPR pour les applications biomédicales.
Grâce à la microscopie cryo-électronique, les chercheurs décrivent pour la première fois la chaîne d’événements précise quand CRISPR charge l’ADN cible et le prépare pour la coupe par l’enzyme Cas3. Ces structures révèlent un processus avec plusieurs couches de détection d’erreur. Cela permet d’avoir une redondance moléculaire qui empêche les dommages génomiques non intentionnels selon les chercheurs.
CRISPR-Cas3 est un sous-type du système CRISPR-Cas, un outil moléculaire largement adopté pour la modification précise de gènes dans la recherche biomédicale. Les aspects de son mécanisme d’action, notamment la façon dont il cherche ses cibles d’ADN, ne sont pas clairs et les préoccupations concernant les mutations hors cible ont soulevé des questions sur la sécurité de CRISPR-Cas pour le traitement des maladies humaines.
Les détails à haute résolution de ces structures permettent de garantir la précision nécessaire et d’éviter les mutations hors cible lors de l’utilisation de CRISPR. Pour résoudre des problèmes de spécificité, nous devons comprendre chaque étape de la formation du CRISPR selon Maofu Liao, professeur adjoint de biologie cellulaire à la Harvard Medical School et co-auteur principal de l’étude. Notre étude montre précisément le mécanisme sur comment l’ADN étranger est capturé par CRISPR allant de la reconnaissance initiale de l’ADN cible et à travers un processus de changements conformationnels qui rendent l’ADN accessible pour la coupure finale par Cas3.
La recherche de la cible
Découvert il y a moins de dix ans, le CRISPR-Cas est un mécanisme de défense adaptatif utilisé par les bactéries pour combattre les virus. Ce processus implique des bactéries qui capturent des fragments d’ADN viral qui sont ensuite intégrés dans son génome et qui produisent de courtes séquences d’ARN connues sous le nom de crRNA (CRISPR RNA). Ces extraits de crRNA sont utilisés pour repérer la présence “ennemie”.
En fonctionnant comme un code à barres, le crRNA est configuré sur les membres de la famille d’enzymes CRISPR. Ces derniers remplissent la fonction de sentinelles qui parcourent les bactéries et surveillent du code étranger. Si ces complexes de riboprotéines rencontrent un matériel génétique qui correspond à son crRNA, alors ils coupent cet ADN pour le rendre inoffensif. Les sous-types CRISPR-Cas, notamment Cas9, peuvent être programmés avec de l’ARN synthétique afin de réduire les génomes à des endroits précis permettant aux chercheurs de modifier des gènes avec une facilité sans précédent.
Pour mieux comprendre le fonctionnement de CRISPR-Cas, Liao s’est associée à Ailong Ke de l’Université Cornell. Leurs équipes se sont concentrées sur le CRISPR de type 1, le sous-type le plus commun dans les bactéries qui utilisent un complexe de riboprotéines connu sous le nom de CRISPR Cascade pour la capture d’ADN et l’enzyme Cas3 pour la coupure de l’ADN étranger.
Une image au microscope cryo-électronique de CRISPR dans une conformation complète de R-Loop. L’ADN (Orange et rouge) est “dénoué” et comparé au CRISPR RNA (bleu) pour déterminer si l’ADN cible doit être coupé par l’enzyme Cas3 – Crédit : Liao lab/Harvard Medical School
Grâce à une combinaison de techniques biochimiques et de microscopie cryoélectronique, ils ont reconstitué une Cascade stable dans différents états fonctionnels et ils ont généré des instantanés de cette Cascade pendant que ce dernier capturait et traitait l’ADN à une résolution de 3,3 angströms, soit environ 3 fois le diamètre d’un atome de carbone.
Voir, c’est croire
Dans CRISPR-Cas3, le crRNA est chargé sur le CRISPR Cascade qui recherche une séquence d’ADN très courte connue sous le nom de PAM qui indique la présence d’ADN viral étranger. Liao, Ke et leurs collègues ont découvert que, lorsque Cascade détecte PAM, il déforme l’ADN à un angle pointu en obligeant une petite partie de l’ADN à se détendre. Cela permet à une partie composée de 11 nucléotides du crRNA de se lier avec un brin d’ADN cible en formant une sorte de “bulle de graine”.
La bulle de graine fonctionne comme un mécanisme de sécurité pour vérifier si l’ADN cible correspond au crRNA. S’ils correspondent, alors la bulle est agrandie et le reste du crRNA se lie avec son ADN cible correspondant formant ce qu’on appelle une structure R-loop. Une fois que le R-Loop est complètement formé, le complexe CRISPR Cascade subit un changement conformationnel qui verrouille l’ADN en place. Il crée également un renflement dans le second brin d’ADN non ciblé. L’enzyme Cas3 lie et coupe l’ADN, au niveau du renflement crée dans le brin d’ADN non ciblé, uniquement lorsque le R-Loop atteint un état de formation complète. Ce n’est pas grave si vous avez eu du mal à comprendre, mais en gros, ce processus révèle une redondance élaborée pour garantir la précision et éviter de faire des erreurs pendant la coupure de l’ADN de la bactérie.
Pour appliquer le CRISPR en médecine humaine, nous devons être sûrs que le système est précis et qu’il ne vise pas les mauvais gènes selon déclaré Ke qui est l’auteur de l’étude. Notre argument est que le sous-type CRISPR-Cas3 a évolué pour être un système précis qui a le potentiel d’être un système plus précis à utiliser pour la modification des gènes. S’il y a un mauvais ciblage, alors nous savons comment manipuler le système, car nous connaissons précisément chaque étape.
Les différentes visions du CRISPR
De nombreuses études ont déjà décrit les structures du CRISPR Cascade sans ADN cible et ses états conformationnels dans la structure R-loop, mais cette étude est la première à révéler la séquence complète des événements de la formation des “bulles de graine” jusqu’à celle de la R-Loop en haute résolution.
Contrairement à Cas9, qu’on compare à un scalpel, le CRISPR-Cas3 fonctionne comme une déchiqueteuse qui broie l’ADN au-delà de toute réparation possible. Et même si le CRISPR-Cas3 possède une utilité limitée pour la modification précise des gènes, c’est un outil pour lutter contre les souches de bactéries résistantes aux antibiotiques. Une meilleure compréhension de ses mécanismes peut élargir la gamme d’applications potentielles pour CRISPR-Cas3.
De plus, tous les sous-types CRISPR-Cas utilisent une certaine version d’une formation de R-Loop pour détecter et préparer l’ADN cible pour la coupure. La compréhension structurelle de ce processus permet aux chercheurs de travailler à la modification de plusieurs types de systèmes CRISPR-Cas pour améliorer leur précision et réduire les risques de mutations hors cible dans les applications biomédicales.
Les scientifiques ont émis l’hypothèse que ces états existaient, mais il manquait la preuve visuelle de leur existence selon le co-premier auteur Min Luo, membre postdoctoral du laboratoire Liao au HMS. Les principaux obstacles proviennent de la reconstitution biochimique stable de ces états et la visualisation structurale à haute résolution. Désormais, on peut les voir pour en être parfaitement convaincus. Nous avons constaté que ces étapes doivent se produire dans un ordre précis selon Luo. Sur le plan évolutionnaire, ce mécanisme est très rigoureux avec une triple redondance afin de s’assurer que ce complexe ne modifie que l’ADN étranger.
Une vidéo montre le fonctionnement précis de CRISPR :
Source : Cell (http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2017.06.012)
