L’ingénieur du laboratoire Cas13 pour simplifier l’identification du coronavirus

Des collaborateurs de l’Université Rice et de l’Université du Connecticut ont en outre conçu le système CRISPR-Cas13 d’édition d’ARN pour augmenter leur puissance de détection d’infimes quantités de virus SARS-CoV-2 dans des échantillons biologiques sans l’étape fastidieuse d’extraction et d’amplification d’ARN nécessaire dans test PCR de référence.

La nouvelle plate-forme a connu un grand succès par rapport à la PCR, trouvant 10 positifs sur 11 et aucun faux positif pour le virus lors de tests sur des échantillons cliniques directement à partir d’écouvillons nasaux. Les chercheurs ont montré que leur technique trouve des signes de SARS-CoV-2 dans attomolar (10^-18) concentrations.

L’étude menée par l’ingénieur chimiste et biomoléculaire Xue Sherry Gao de la George R. Brown School of Engineering de Rice et les chercheurs postdoctoraux Jie Yang de Rice et Yang Song du Connecticut apparaît dans Nature Chemical Biology.

Cas13, comme son cousin plus connu Cas9, fait partie du système par lequel les bactéries se défendent naturellement contre les phages envahisseurs. Depuis sa découverte, CRISPR-Cas9 a été adapté par des scientifiques pour éditer des génomes d’ADN vivants et s’avère très prometteur pour traiter et même guérir des maladies.

Et il peut être utilisé d’autres manières. Cas13 seul peut être amélioré avec de l’ARN guide pour trouver et couper des séquences d’ARN cibles, mais aussi pour trouver une “collatérale”, dans ce cas la présence de virus comme le SARS-CoV-2.

“La protéine Cas13 conçue dans ce travail peut être facilement adaptée à d’autres plates-formes précédemment établies”, a déclaré Gao. “La stabilité et la robustesse des variantes de Cas13 conçues les rendent plus adaptées aux diagnostics au point de service dans les zones à faibles ressources lorsque les machines PCR coûteuses ne sont pas disponibles.”

Yang a déclaré que le Cas13 de type sauvage, tiré d’une bactérie, Leptotrichia wadei, ne peut pas détecter le niveau attomolaire d’ARN viral dans un délai de 30 à 60 minutes, mais la version améliorée créée à Rice fait le travail en environ une demi-heure et détecte le SRAS -CoV-2 à des concentrations bien plus faibles que les tests précédents.

Elle a dit que la clé est une boucle en épingle à cheveux flexible et bien cachée près du site actif de Cas13. “C’est au milieu de la protéine près du site catalytique qui détermine l’activité de Cas13”, a déclaré Yang. “Étant donné que Cas13 est vaste et dynamique, il était difficile de trouver un site pour insérer un autre domaine fonctionnel.”

Les chercheurs ont fusionné sept domaines de liaison d’ARN différents à la boucle, et deux des complexes étaient clairement supérieurs. Lorsqu’ils trouveraient leurs cibles, les protéines deviendraient fluorescentes, révélant la présence du virus.

“Nous avons pu voir que l’activité accrue était cinq ou six fois supérieure à celle du Cas13 de type sauvage”, a déclaré Yang. “Ce nombre semble petit, mais c’est assez étonnant avec une seule étape d’ingénierie des protéines.

“Mais cela ne suffisait toujours pas pour la détection, nous avons donc déplacé l’ensemble du test d’un lecteur de plaques à fluorescence, qui est assez volumineux et non disponible dans les environnements à faibles ressources, vers un capteur électrochimique, qui a une sensibilité plus élevée et peut être utilisé pour le point -des diagnostics de soins », a-t-elle déclaré.

Avec le capteur prêt à l’emploi, Yang a déclaré que la protéine modifiée était cinq ordres de grandeur plus sensible pour détecter le virus par rapport à la protéine de type sauvage.

Le laboratoire souhaite adapter sa technologie aux bandes de papier comme celles des tests d’anticorps COVID-19 à domicile, mais avec une sensibilité et une précision beaucoup plus élevées. “Nous espérons que cela rendra les tests plus pratiques et à moindre coût pour de nombreuses cibles”, a déclaré Gao.

Les chercheurs étudient également une meilleure détection des virus Zika, de la dengue et Ebola et des biomarqueurs prédictifs des maladies cardiovasculaires. Leurs travaux pourraient conduire à un diagnostic rapide de la gravité de la COVID-19.

« Différents virus ont des séquences différentes », a déclaré Yang. “Nous pouvons concevoir un ARN guide pour cibler une séquence spécifique que nous pouvons ensuite détecter, ce qui est la puissance du système CRISPR-Cas13.”

Mais parce que le projet a commencé juste au moment où la pandémie s’est installée, le SRAS-CoV-2 était un foyer naturel. “La technologie est tout à fait adaptée à toutes les cibles”, a-t-elle déclaré. “Cela en fait une très bonne option pour détecter toutes sortes de mutations ou différents coronavirus.”

“Nous sommes très enthousiastes à propos de ce travail en tant qu’effort combiné de biologie structurale, d’ingénierie des protéines et de développement de dispositifs biomédicaux”, a ajouté Gao. “J’apprécie grandement tous les efforts des membres et collaborateurs de mon laboratoire.”

Les co-auteurs de l’article sont le chercheur postdoctoral Rice Xiangyu Deng, le premier cycle Jeffrey Vanegas et l’étudiant diplômé Zheng You; les étudiants diplômés Yuxuan Zhang et Zhengyan Weng de l’Université du Connecticut ; superviseur de la microbiologie Lori Avery et Kevin Dieckhaus, professeur de médecine, de UConn Health ; Yi Zhang, professeur adjoint de génie biomédical à l’Université du Connecticut ; et Yang Gao, professeur adjoint de biosciences à Rice.

Xue Sherry Gao est professeur adjoint Ted N. Law de génie chimique et biomoléculaire à Rice.

La National Science Foundation (2031242, 2103025), la Welch Foundation (C-1952, C-2033-20200401) et le Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RR190046) ont soutenu la recherche.