Imagerie optique des interactions dynamiques entre molécules dans une cellule —


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  • La microscopie à super-résolution permet d’acquérir des images de fluorescence de cellules, d’organites et de complexes moléculaires avec une résolution spatiale sans précédent. Cependant, cette résolution n’est pas suffisante pour résoudre des protéines aussi petites que quelques nanomètres et leurs interactions avec d’autres molécules ou l’architecture de complexes protéiques. Il empêche, par exemple, l’étude de l’interaction moléculaire des neurones dans les processus d’apprentissage et de mémoire.

    Dépasser les limites de résolution dynamique

    Développée par le groupe de recherche du professeur Markus Sauer (Rudolf Virchow Center and Biocenter) et du Dr Gerti Beliu (Rudolf Virchow Center) de l’Université de Würzburg, la nouvelle analyse d’empreintes digitales par photocommutation permet l’imagerie optique des interactions dynamiques avec d’autres molécules dans la cellule. « Jusqu’à présent, il n’existe aucune méthode permettant de manière fiable la résolution optique structurelle dans les cellules dans la plage inférieure à 10 nm. En élucidant cette cause sous-jacente de la barrière, nous avons réussi pour la première fois, en combinaison avec de nouvelles méthodes de marquage direct, à permettre à un cellulaire résolution de quelques nanomètres. Ce progrès permet de révéler les fonctions moléculaires et l’architecture de composants importants de nos cellules », rapporte Sauer.

    Les méthodes de microscopie de localisation de molécules uniques telles que dSTORM, développées dans le groupe du professeur Markus Sauer, permettent des résolutions de l’ordre de 10 à 20 nm. En combinaison avec des méthodes d’éclairage structuré, des précisions de localisation allant jusqu’à 1 nm pourraient être atteintes pour les colorants. Malheureusement, cette grande précision de localisation n’a pas pu se traduire par une résolution spatiale de quelques nanomètres dans les cellules.

    Le problème : les méthodes de marquage actuelles, par exemple l’immunomarquage avec un anticorps, provoquent une erreur d’espacement de plus de 10 nm. En conséquence, la taille des molécules de marquage empêche la résolution à l’échelle nanométrique. Les autres causes de la barrière de résolution inférieure à 10 nm étaient auparavant inconnues. « Dans notre publication, nous avons maintenant montré pour la première fois que les taux de photocommutation (clignotement) des colorants entre un état allumé et éteint sont fortement affectés à des distances inférieures à 10 nm en raison de divers processus de transfert d’énergie entre les colorants. Il en résulte un cluster d’états passants pendant les premières secondes d’une expérience associée à un photoblanchiment rapide des colorants, ce qui rend leur localisation individuelle plus difficile », explique Sauer. « La probabilité de localisation réduite des colorants entraîne donc une résolution structurelle plus faible que ce à quoi on pourrait s’attendre sur la base de la précision de localisation individuelle. Ceci est similaire à un orchestre lorsque tous les instruments jouent leurs contributions simultanément au début de la pièce; il est impossible de choisissez les pistes sonores individuelles. »

    La trace d’intensité de fluorescence

    Cependant, l’empreinte digitale de photocommutation et le temps de décroissance de la fluorescence contiennent également des informations sur le nombre de colorants présents et, en raison de la dépendance à la distance du transfert d’énergie, également des informations sur leurs distances sans pouvoir résoudre optiquement les colorants individuels. En incorporant des acides aminés non naturels dans des récepteurs membranaires multimériques par l’expansion du code génétique suivie d’un marquage par clic bioorthogonal avec de petits colorants fluorescents, les groupes de recherche de Würzburg ont maintenant pu montrer à l’étape suivante comment un marquage spécifique au site des protéines dans les cellules peut être réalisé sans erreurs d’espacement avec des distances inférieures à 10 nm. « En analysant les empreintes digitales de photocommutation des récepteurs multimériques dans la membrane plasmique, nous avons ainsi pu pour la première fois estimer les distances entre les sous-unités réceptrices dans la plage de 5 à 7 nm dans les cellules et déterminer le nombre de sous-unités marquées », explique Beliu.

    Visualiser et comprendre la communication moléculaire

    Dans la prochaine étape, l’équipe de recherche a l’intention d’optimiser l’analyse des empreintes digitales de photocommutation et de l’utiliser en combinaison avec la microscopie de localisation d’une seule molécule en utilisant des schémas d’excitation à motifs et DNA-PAINT pour une imagerie fiable à super-résolution dans les cellules avec une résolution inférieure à 10 nm. Cela devrait fournir de nouvelles informations sur l’organisation moléculaire des structures cellulaires, des organites et des complexes multiprotéiques, ainsi que sur l’élucidation structurelle des structures protéiques à l’aide de méthodes optiques.

    La méthode nouvellement développée offre non seulement des informations uniques sur les mécanismes moléculaires dans la recherche sur les infections, les lipides et le cancer : la prise d’empreintes par photocommutation a également le potentiel de représenter de manière plus réaliste la dynamique et la complexité des récepteurs du système nerveux qui sont importants pour la transduction du signal au niveau des synapses. de neurones. Cette interaction de neurones définit nos processus quotidiens d’apprentissage et de mémoire. « Il est donc fondamentalement important de comprendre comment cet orchestre moléculaire s’assemble et fonctionne », déclare Beliu, décrivant l’importance de ces résultats de recherche.

    Source de l’histoire :

    Matériaux fourni par Université de Wurtzbourg. Remarque : Le contenu peut être modifié pour le style et la longueur.

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