La microscopie à fluorescence montre comment les cellules vivantes forment des vésicules pour transporter des cargaisons comme des facteurs de croissance


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  • Les cellules ont un moyen intelligent de transporter des cargaisons telles que des facteurs de croissance à travers la membrane cellulaire et dans la cellule. C’est ce qu’on appelle l’endocytose médiée par la clathrine. Les molécules de la protéine clathrine se rassemblent à l’intérieur de la membrane cellulaire et déforment la membrane pour former ce qui ressemble à une fosse vue de l’extérieur.

    Une fois remplie de cargaison, la fosse se pince pour former une vésicule liée à la membrane recouverte de clathrine à l’intérieur de la cellule, qui se dirige ensuite vers sa destination appropriée. Dans les cellules cultivées, des centaines de ces vésicules recouvertes de clathrine peuvent se former chaque minute.

    Cependant, des modèles contradictoires existent sur la façon dont ces vésicules s’assemblent, ce qui a laissé un manque de connaissances critique. Un modèle est le modèle à courbure constante, où la courbure est induite simultanément avec la polymérisation de la clathrine. Un autre, le modèle de transition plat à courbe, dit qu’un réseau plat de molécules de clathrine s’assemble d’abord à l’intérieur de la membrane cellulaire, suivi d’un changement de conformation pour former la fosse et la vésicule recouvertes de clathrine.

    Les preuves des deux modèles peuvent être vues par microscopie électronique – mais ce sont des instantanés statiques de cellules fixes qui ne révèlent pas la dynamique réelle à l’échelle nanométrique et les voies possibles de l’endocytose médiée par la clathrine.

    Aujourd’hui, Alexa Mattheyses et ses collègues de l’Université de l’Alabama à Birmingham et de l’Université Emory comblent ce manque de connaissances, en utilisant une imagerie par microscopie à fluorescence sophistiquée appelée microscopie STAR. Cela leur a permis de suivre la formation de vésicules recouvertes de clathrine dans les cellules vivantes du début à la fin, sur des périodes allant jusqu’à 100 secondes.

    Leur étude, rapportée dans la revue Communication Natureprend en charge ce qu’on a appelé le modèle flexible de formation de vésicules recouvertes de clathrine, qui comprend à la fois les voies de transition à courbure constante et de transition plat à courbe.

    « Nous montrons que l’accumulation de clathrine est préférentiellement simultanée avec la formation de courbure au niveau des vésicules recouvertes de clathrine à durée de vie plus courte, mais favorise une transition plate à courbe au niveau des vésicules recouvertes de clathrine à durée de vie plus longue », a déclaré Mattheyses, professeur agrégé au Département de l’UAB. Biologie cellulaire, développementale et intégrative. « Ensemble, nos résultats fournissent des preuves expérimentales en faveur du modèle flexible de l’endocytose, où un seul modèle de formation de courbure ne peut pas englober l’hétérogénéité de la dynamique de l’endocytose à médiation cellulaire. »

    La microscopie à ratiométrie axiale à deux longueurs d’onde simultanées, ou STAR, est basée sur la fluorescence à réflexion interne totale, ou TIRF, microscopie qui permet la visualisation de protéines marquées par fluorescence au niveau ou à proximité de la membrane plasmique, sur une distance d’environ 100 à 200 nanomètres. En microscopie STAR, la protéine est marquée avec deux fluorophores qui ont des longueurs d’onde d’excitation différentes pour tirer parti de la profondeur de pénétration dépendante de la longueur d’onde du champ évanescent. Le résultat est une capacité à résoudre simultanément à la fois l’accumulation de protéines, telle que mesurée par l’intensité de fluorescence, et la distance de la membrane plasmique, telle que mesurée par le rapport d’intensité de fluorescence des deux fluorophores. Cette distance, qui représente la distribution z du nanomètre, est une mesure de courbure dans l’étude actuelle.

    À l’aide de cellules de fibroblastes de rein de singe, Mattheyses et ses collègues ont marqué la chaîne légère de la clathrine CLCa avec des fluorophores qui ont des longueurs d’onde d’excitation de 488 et 647 nanomètres. Ils ont ensuite stimulé les cellules avec un facteur de croissance épidermique pour induire une endocytose. L’analyse quantitative à l’aide du supercalculateur UAB Cheaha a abouti à 1 948 accumulations de CLCa-STAR à partir de 13 cellules.

    Ils ont trouvé des preuves de trois modèles d’initiation de la courbure : la nucléation, où la formation de la courbure a commencé moins d’une seconde avant l’apparition de la clathrine ; courbure constante, où la formation de la courbure a commencé une à quatre secondes après l’arrivée de la clathrine ; et transition plat à courbé, où la courbure a commencé plus de quatre secondes après l’accumulation de clathrine.

    Pour analyser davantage les données, les chercheurs ont regroupé les événements endocytaires en fonction des durées de vie de la clathrine et des modèles de formation de vésicules. Cela a révélé des caractéristiques intéressantes.

    « Nous avons constaté que les événements endocytaires de courte durée, moins de 20 secondes, se formaient principalement via le modèle à courbure constante, tandis que les événements plus longs – plus de 20 secondes – favorisaient la transition plat à courbe », a déclaré Mattheyses. « La proportion d’événements de nucléation était plus petite et favorisait les événements de courte durée. »

    Pour tester si ce modèle flexible d’endocytose médiée par la clathrine peut être universel parmi différentes lignées cellulaires, les chercheurs ont également imagé des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine, stimulées par le facteur de croissance endothélial vasculaire pour stimuler l’endocytose. Ils ont trouvé une gamme similaire d’événements endocytaires.

    « Ces données montrent l’hétérogénéité auparavant non appréciée de la dynamique de l’endocytose médiée par la clathrine et de la plasticité de la formation de vésicules recouvertes de clathrine, et elles suggèrent que différents types de cellules ou de cargaisons peuvent utiliser cette flexibilité pour influer sur le mode de formation de la courbure », a déclaré Mattheyses. « Les recherches futures utilisant la microscopie STAR définiront comment le recrutement de protéines accessoires et le rôle des paramètres biophysiques contribuent à la formation de vésicules et comment différentes dynamiques de clathrine ont un impact sur la signalisation et l’homéostasie cellulaire. »

    Les co-auteurs de l’étude, « Imaging vesicle formation dynamics supports the flexible model of clathrin-mediated endocytosis », sont Tomasz J. Nawara, Yancey D. Williams II, Tejeshwar C. Rao et Elizabeth Sztul, UAB Department of Cell, Developmental and biologie intégrative ; et Yuesong Hu et Khalid Salaita, Département de chimie de l’Université Emory, Atlanta, Géorgie.

    Mattheyses et Salaita ont développé ensemble la microscopie STAR à Emory en 2015. Mattheyses travaille avec la microscopie TIRF depuis son doctorat. travail à l’Université du Michigan avec Daniel Axelrod, Ph.D., considéré par beaucoup comme un pionnier de la technique.

    Le soutien est venu de la subvention GM3099 des National Institutes of Health, de la subvention CAREER 83200 de la National Science Foundation et de la subvention 906086 de l’American Heart Association.

    La biologie cellulaire, développementale et intégrative est un département de la faculté de médecine Marnix E. Heersink de l’UAB.

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